Игра продолжается вскоре после событий Assassin's Creed, где, в 2012, Дезмонд Майлс (Нолан Норт) пленник «Абстерго Индастриз», которого используют для дешифрования его генетической памяти о его предке-убийце Альтаире в машине «Анимус». «Абстерго», современный эквивалент рыцарей Тамплиеров, использовали Дезмонда, чтобы определить местонахождение мощного артефакта, именуемого «Частицей Эдема». Используя Орлиное зрение, полученного в результате «эффекта просачивания» (из-за частого нахождения в Анимусе), Дезмонд стал видеть сообщения и символы, написанные кровью на его стене спальни предыдущим испытуемым, именуемым «Объект 16». Люси Стиллман (Кристен Белл), сотрудник Абстерго и член братства современных ассасинов, освобождает Дезмонда и прячет его в секретном укрытии к двум другим ассасинам, Шону Хастингсу (Дэнни Уоллес) и Ребекке Крэйн (Элиза Шнайдер). С их аналогом «Анимус 2.0», они приглашают Дезмонда помочь им использовать его генетическую память о его предке, Эцио Аудиторе да Фиренце, по двум причинам: тренировать Дезмонда навыкам ассасина с помощью эффекта просачивания, и найти другие Частицы Эдема.

Действие игры разворачивается в Италии, в Эпоху Возрождения, конец XV века. Главным героем игры становится семнадцатилетний юноша по имени Эцио. Отца Эцио, Джованни Аудиторе, предал его лучший друг, и в ходе обвинения, отец и братья Эцио были повешены. Для Эцио это была душевная травма, потерять семью. Он убивает предателя его отца и пытается укрыться вместе с матерью и сестрой у своего дяди Марио, на вилле Аудиторе в Монтериджони.

Позже Эцио узнает, что его семью предала семья Пацци, и он решает расквитаться с ней. Сперва он убивает младшего из этой семьи, Вьери Пацци, затем его отца, Франческо Пацци, а затем старшего из семьи предателей — Якопо Пацци. Из собрания тамплиеров, в котором непосредственно участвовал Якопо, Эцио узнал, что его приключение заводит его в Венецию, где он и гильдия воров убивают одного из заговорщиков — Эмилио Барбариго, который отравил венецианского дожа. Затем, Эцио убивает других прихвостней главного своего врага — некоего испанца. После нахождения частицы Эдема — яблока Эдема, Эцио отправляется в Романью, где помогает Никколо Макиавелли и Катерине Сфорца защитить их город — Форли. Но таинственное яблоко было украдено, и поиски его приводят нашего героя обратно во Флоренцию. Эцио убивает девять политических деятелей и заговорщиков по всему городу и в конце концов отбирает яблоко у вора — Джироламо Савонаролло. Главный враг Эцио, Родриго Борджиа, становится Папой римским, и Эцио отправляется на решающий бой в Рим, где побеждает главного врага игры и узнает великие тайны. Это и то, что Эцио таинственный пророк, и то, что скоро грядет конец света.

Эцио предстоит согласно сюжетной линии ликвидировать участников заговора, во главе которого стоит Родриго Борджиа.

Родриго Борджиа — глава итальянских тамплиеров, папа римский. Борджиа стремился соединить две части Эдема и объединить Италию под властью тамплиеров. Именно он виновен в смерти отца и братьев Эцио. Родриго Борджиа является конечной целью Эцио и главным антагонистом игры.
Уберто Альберти — прокурор, старый друг семьи Аудиторе. Именно ему Эцио относит важное письмо, в котором содержатся доказательства непричастности к заговору семьи Аудиторе. Из-за любимой женщины предал семью Эцио и объединился с тамплиерами.
Вьери Пацци — молодой дворянин, младший сын Франческо Пацци. Вьери склонен к расточительству и жестокости. Много раз пытался причинить вред семье Эцио. Даже его отец говорит о своем сыне как о непокорном и агрессивном человеке. Однако в своем письме к Франческо Пацци Фра Джокондо пишет, что Вьери просто необходима отцовская любовь и его еще вполне можно исправить.
Франческо Пацци — банкир, представитель флорентийской семьи Пацци. Являлся центральной фигурой заговора против Лоренцо Медичи.
Бернардо Барончелли — банкир, пособник тамплиеров. Принимал участие в заговоре против Лоренцо Медичи. После неудачной попытки восстания против власти Медичи во Флоренции укрылся в Тоскане.
Антонио Маффеи — священник, участник заговора против Лоренцо Медичи. После покушения на Лоренцо скрылся в крепости Сан-Джиминьяно и вел проповеди, направленные против семьи Медичи.
Стефано да Баньоне — священник, советник Якопо Пацци. После неудачного заговора против Медичи сбежал в аббатство недалеко от Сан-Джаминьяно.
Франческо Сальвиати — архиепископ Пизы, мечтал занять ту же должность во Флоренции, однако Медичи не давали ему сделать это, так что Сальвиати присоединился к тамплиерам. Именно он ввел войска тамплиеров в город. После гибели Франческо Пацци поспешил укрыться в своей вилле недалеко от Сан-Джаминьяно.
Якопо Пацци — глава семьи Пацци и семейного банка. Многократно добивался суда над Лоренцо Медичи, однако против него у Якопо ничего не было, поэтому Пацци вступил в сговор с тамплиерами в надежде покончить с правлением Медичи во Флоренции.
Эмилио Барбариго — глава гильдии купцов, влиятельный человек в Венеции. Почти единолично финансировал венецианскую городскую стражу, установил монополию на рынке, что позволило ему быстро продвинуться по карьерной лестнице.
Карло Гримальди — дворянин, член Совета десяти. Благодаря умению хранить тайны и угождать высшим чиновникам добился уважения среди дворян. Участвовал в заговоре против венецианского дожа Джованни Мочениго.
Марко Барбариго — дворянин, участник заговора против Джованни Мочениго. Имеет личного телохранителя Данте Моро, женат на его бывшей супруге.
Данте Моро — телохранитель Марко Барбариго, бывший капитан венецианской городской стражи. После покушения, подстроенного Марко, повредился в уме, что позволило Барбариго заставить Моро стать его телохранителем.
Сильвио Барбариго — член Верховного трибунала Венеции, прокурор. Участник заговора против Джованни Мочениго. После гибели Марко Барбариго попытался бежать из Венеции.
Чекко Орси — профессиональный вор, брат Людовико Орси. По приказу Родриго Борджиа напал на Форли.
Людовико Орси — профессиональный вор, брат Чекко Орси. Вместе со Чекко напал на Форли по приказу Родриго Борджиа.
Джироламо Савонарола — монах-доминиканец, не состоял в сговоре с Родриго Борджиа. После того, как Савонарола находит Частицу Эдема, он захватывает власть во Флоренции с помощью этого древнего артефакта.