События игры развиваются в конце XV — начале XVI века. Assassin’s Creed: Brotherhood является прямым сиквелом игры Assassin's Creed II. Сюжет развивается непосредственно после окончания событий оригинальной игры. Главным героем игры является итальянский дворянин-ассасин Эцио Аудиторе да Фиренце, который продолжает свою борьбу с орденом тамплиеров в Риме.

Игра Assassin’s Creed: Brotherhood завершает сюжетную линию Эцио в рамках серии Assassin’s Creed.

Геймплей игры стандартен для серии Assassin’s Creed и является развитием игрового процесса Assassin's Creed II. Как и в предыдущих частях, основой механики игры является паркур, использование толпы и различных укрытий для незаметных убийств («стелс») и развитой системы ближнего боя. Открытый мир игры представляет некоторою степень нелинейности прохождения, хотя основные сцены игры и её хронологические рамки выстроены с помощью системы скриптов. Непосредственное прохождение сюжетной линии занимает около 15 часов. Кроме того, в отличие от игры Assassin’s Creed II, у игроков появилась возможность переигрывать все сюжетные миссии игры.

Действие игры преимущественно происходит в Риме XVI века, однако периодически события переносятся в современность, где главным героем является Десмонд Майлз, обучающийся искусствам ассасина с помощью машины «Анимус 2.0», позволяющей считывать генетическую информацию о предках Десмонда и погружать его в прошлое. Главный герой исторической части игры — Эцио Аудиторе да Фиренце , один из лидеров и наставников ордена ассасинов. Злейшие враги ассассинов — представители влиятельного клана Борджиа, полностью контролирующие политику Рима и его коррумпированных лидеров.

По сравнению с предшествующей игрой, боевая система не претерпела серьёзных изменений. По словам разработчиков, динамика боя стала более активной и наступательной. Теперь поощряется быстрое наступление; контратаки стали менее эффективными. Система поведения NPC стала агрессивной и игрока атакуют сразу несколько противников Увеличилось количество оружия, появилась возможность использовать стационарные пушки в некоторых игровых ситуациях. Кроме того, серьёзно пересмотрена роль лошади, на которой теперь можно передвигаться и в пределах города. Лошадь участвует в некоторых элементах паркура.

В процессе выполнения заданий Эцио встречает и взаимодействует с различными историческими персонажами, такими как Леонардо да Винчи, Никколо Макиавелли, Катерина Сфорца; представители рода Борджиа являются основными противниками игры. Сюжет игры в целом чётко вписан в исторические рамки.
Рим

Действие игры в основном происходит в Риме, который, по словам разработчиков, невозможно было реализовать в полном объёме в рамках игры Assassin's Creed II, так как он настолько велик, что чтобы его пересечь пешком, нужно несколько часов. Из-за разрушительной политики властей Ватикана город пришёл в упадок и отстал в развитии от таких центров, как Флоренция и Венеция, и Эцио будет способствовать его восстановлению, уничтожая тамплиеров и вкладывая собственные средства в возрождение освобождённых территорий. Город делится на четыре района-локации: исторический район, деревня под стенами большого города, торговая часть города и небольшой остров на реке Тибр, который является пристанищем и убежищем ордена ассасинов от врагов.
Управление ассасинами

Эцио, ставший главой ордена ассасинов, может контролировать действия всех агентов ордена. Он занимается вербовкой и обучением молодых членов ордена, которые помогают ему в процессе выполнения сюжетных заданий. Эцио может рассылать группы завербованных и обученных им убийц в разные страны мира для выполнения различных задач. Так, например, он может отправить ассасинов в Испанию, Англию и Германию.
Сюжет

40-летний Эцио Аудиторе да Фиренце поднялся на вершины иерархии ордена после окончания событий игры Assassin's Creed II. Отомстив убийцам отца и братьев, он покинул Рим и наслаждается жизнью в своей вилле. Действие игры начинается в 1499 году. Фамильная резиденция рода Аудиторе Монтериджони осаждена наёмниками семьи Борджиа. Осаду проводит сын Родриго Чезаре Борджиа. В битве погибает дядя Эцио ,Марио. После этого действие игры переносится в 1503 год где Эцио, как глава Ордена, пытается найти убийц своих родственников и отомстить им.
Мультиплеер

Assassin’s Creed: Brotherhood — первая игра серии, в которой реализован мультиплеер. Как было показано во время побега из штаба организации «Абстерго» (англ. «Abstergo») в начале игры Assassin's Creed II, тамплиеры построили специальный объект, содержащий в себе несколько десятков устройств «Анимус». Этот объект служит полигоном для подготовки новобранцев ордена с целью ликвидации ордена ассасинов. Тамплиеры намерены использовать технику и приспособления своих противников, используя воспоминания самых квалифицированных ассасинов.

В мультиплеере доступны две фракции: организация тамплиеров «Абстерго» и орден ассасинов. В мультиплеере будут представлены несколько игровых персонажей-классов (подтверждены — Куртизанка (англ. Courtesan); Охотник (англ. Hunter); Парикмахер (англ. Barber); Палач (англ. Executioner); Дворянин (англ. Noble); Священник (англ. Priest); Доктор (англ. Doctor) и Торговец (англ. Merchant)[12]); Кузнец; Солдат; и как дополнительный контент-Арлекин (англ. Harlequin) у каждого из которых имеется своя особая техника убийства и свой комплекс навыков и оружия. В игре присутствуют несколько различных режимов мультиплеерной игры. На данный момент подтверждён режим «Розыск» (англ. «Wanted»), в котором участвуют от 6 до 8 человек на небольшой карте, где каждый игрок преследует другого. В начале раунда каждый игрок получает определённую замаскированную цель, которую надо уничтожить; при этом, сам игрок так же является чьей-то целью. На каждой карте будут находиться управляемые компьютером NPC, под которых и маскируются игроки, выбирая свой игровой класс.

Мультиплеер игры будет осуществляться через игровые сети Xbox Live, PlayStation Network и Games for Windows — Live.